Artigos internacionais

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Revista Española de Ozonoterapia vol. 1, nº 1. pp.44-53, 2011 Editado por AEPROMO (Asociación Española de Profesionales Médicos en Ozonoterapia) Creative Commons: reconocimiento.

1-Adjuvant Hyperbaric Oxigen and ozone therapy in the treatment of chonic leg and foot ulcers (pilot clinical study).

2-Hyperbaric oxygen therapy Ozone therapy Leg ulcers Foot ulcers.

3-Abstract This pilot study describes the clinical effects of Adjunctive Hyperbaric Oxygen Therapy (HBOT) and Ozone Therapy in the treatment of chronic ulcers most of which did not respond to standard wound care and conventional methods of therapy and the patients were threatened by amputation. HBO and Ozone Therapy increased the healing rate of these ulcers, and avoided amputation. Adjuvant HBO and Ozone Therapy showed effective adjunctive therapy and we recommend a Randomized Controlled Trial to prove that effect.

4–Introduction Leg ulcers are a common problem thought to affect about 1% of the population at some point in their lives and about 1.5 per 1000 people at any one time. Leg ulcers are more common in women than men, and the prevalence increases with age. Venous disease is present in the majority of cases; peripheral vascular disease may coexist or may be the main cause of an ulcer. Other disease processes may also be involved, such as diabetes or rheumatoid disease. Leg ulceration is chronic, and an ulcer may be present for months or years without healing. After healing, recurrence rates are high. There are many approaches to management, with large variations in practice at local and international levels. (1) Hyperbaric Medicine is the fascinating use of barometric pressure for delivering increased oxygen dissolved in plasma to body tissues. Hyperbaric oxygen therapy (HBOT) is a form of treatment in which a patient breathes 100% oxygen at higher than normal atmospheric pressure that is greater than 1 atmosphere absolute (ATA). Therapy is given in special therapeutic chambers, which were earlier used primarily to treat illnesses of deep sea divers. (2, 3, 4) Ozone (O3) is a strong antioxidant. (5) Ozone can exert protective effects by oxidative preconditioning, stimulating and/or preserving the endogenous antioxidant systems and by blocking the xanthine / xanthine oxidase pathway for reactive oxygen species generation, as demonstrated in studies of the damage induced by carbotetrachloride (CCL4) or by hepatic and renal ischemia-reperfusion. (6, 7, 8, 9) Ozone has been used with good results in the treatment of patients with diabetic foot, because of its germicidal properties and its influence on the processes of oxygen metabolism, and other effects. (10)

5-Aim of the Work The present pilot study aims to clinically evaluate the effectiveness of two different modalities of OxyTherapy; Hyperbaric Oxygen and Ozone Therapy in the treatment of chronic ulcers. Patients and Methods Patients: This pilot study represents experience in the management of 15 cases, who had clinically diagnosed leg or foot ulcer, treated throughout the period between 2007 and 2008. Patients were grouped into three different groups according to the severity of the case and treatment modality; Hyperbaric Oxygen Therapy; 5 patients; Ozone Therapy; 5 patients; and Combined Modality Therapy, 5 patients Methods: Diagnosis/Assessment; medical history, physical examination, ulcer examination, clinical investigations, ankle brachial pressure index (ABPI), investigations to exclude other causes, wound measurement, identifying hard-to-heal ulcers. Management of wounds: the general rules to treat wounds include the accurate diagnosis and classification of the Wound, the vascular Status (ABPI), good control of blood glucose, correction of underlying cause, correction of malnutrition, treatment of Infection, debridement: of necrotic tissue and underlying osteomyelitis, obliteration of dead space as a result of debridement, .off-loading, wound care, and finally adjuvant therapy (11) . Hyperbaric Oxygen Therapy: Following the protocol adapted by Jain KK (12) , sessions was done in the Multiplace Baramed 6/2/6 Hyperbaric Chambers, ETC Inc., USA. Oxygen was inhaled from a helmet or a mask at a pressure of: 2- 2.5 ATA (atmospheric pressure, equals 10 – 15 meters under Sea Surface).

6-Sessions were initially done on daily basis (6 sessions/ week). Intermittent, each session will be 90- 120 minutes, with rest every 20 sessions. The first clinical evaluation was done after 5 sessions. Ozone Therapy: Following the protocol adapted by Renate Viebahn-Hänsler (2007) (13) , patients to be treated daily with ozone (generated by an ozone generator, Ozonosan Alpha 1, Germany), by rectal insufflation as systemic therapy (with an ozone concentration up to 35 µg), and local treatment by covering the lesion by a plastic bag, filled with ozone at a concentration of 60 µg, decreased up to 20). The first clinical evaluation was done after 5 sessions. With improvement, the frequency of sessions was decreased gradually. Combined: The combined modality was achieved by systemic HBOT and Local O3 as described above. For local treatment; Standard wound care, topical application of ozonated olive oil and wound dressing. Results Ten patients (66.7%) had type 2 diabetes mellitus of them 8 (53.3%) were IDDM. The mean age was 53.3 ± 9.86 years (37- 68 years). The sex distribution was 10 males (66.7%) and 5 females (33.3%), with a ratio of 2:1. In addition, 10 patients (66.7%) were threatened by amputation. The main data of the studied patients is shown in table 1.

7-Outcome Successful results were achieved in 11 (73.3%) out of the studied 15 patients. The most effective modalities were combined modality 4 out of 5 (80%), the ozone therapy 4 out of 5 (80%), the HBOT 3 out of 5 (60%). Considering the severity of cases, combined modality was the most effective but with more selection of cases which suffered more from ischemia, infection and/or edema. Ozone therapy was very effective, easier to apply with less complication and higher patient compliance. A striking feature was that out of the 10 patients threatened by amputation, seven (70%) patients had their limbs saved. Clinical case treated with HBOT: Male, 38 yrs, smoker not diabetic. complaining of recurrent left leg ulcer since 1 month provoked by Trauma, then infected wound, gradually increase

8-Clinical case treated with ozone therapy: A 65 years male IDDM patient was diagnosed as Rt diabetic foot gangrene; Wagner 4 classification. The main problem was diabetic foot, Infection and neuropathy. He was recommended for Right below knee amputation. He was unfit for HBOT because of his heart problem. He received ozone therapy daily (Topical 80→60 µg/ml) and rectal insufflation 15 – 35 µ/ml 250 – 300 ml for 5 days followed by surgical debridement. Ozone therapy continued 3 sessions / week for seven weeks then twice / week for four weeks and finally once / week for 12 weeks. This was followed by using ozonated olive oil only. The maximum concentration for rectal insufflation was 35 µ/ml and the volume was 300 ml. Topical ozone concentration dropped gradually from 80 µ/ml till 20 µ/ml.
Another case of 68 years male, NIDDM, smoker with severe pains of the left leg and foot. He suffered from intermittent claudications and was unfit for revascularization. There was a pressure ulcer of the left heel and left superficial safenous artery occlusion.

9-Clinical cases treated with combined HBOT and ozone therapy: A 55 years female patient with uncontrolled IDDM and ulcer of the left heel. She was suffering from pains of the left leg and foot. She passed serial debridements and unfit for re-vascularization. She was planned for below knee amputation. There was complete occlusion of tibialis posterior artery and occluded segments of tibialis anterior and superficial safenous arteries. There was left leg ischemia (ABPI 0.65), severe diabetic foot infection, gangrenous arterial Ulcer of the Heel. The surgical decision was to control diabetes, ischemia, and infection. This to be followed by debridement, grafting (plastic surgery) and proper foot wear. The oxy-therapy protocol was to start with HBOT till control of ischemia and infection by 20 sessions daily; 6 days / week. This is to be followed by topical ozone three sessions / week (60 µg/ml) till wound is clean; then three sessions / week (40→20 µg/ml) to promote healing. The total therapy was 23 sessions HBOT and 37 sessions topical ozone in a four month period.
Discussion HBO promotes wound healing by counteracting tissue hypoxia and is a valuable adjunct in management of ischemic, infected, and non-healing wounds. (12) It is generally accepted that correction of woundhypoxia is required to provide enough O2 that would support growth of regenerating tissues. (14) Rationale of HBO for ulcers based on the hypoxia theory has been a matter of controversy, between authors who do not recommend the use of HBOT in venous ulcers; reporting that the role of HBOT seems very limited, and that reported successful cases would heal without the need for HBO, (15) or reporting that it is difficult to justify such an expensive, ineffective, complication-prone treatment modality for problem extremity wounds. (16) Several studies reported favorable results in treating venous ulcers with HBO. (17, 18) Specifically, two Double-Blind, Randomized-controlled studies; the first has significantly demonstrated an improvement in venous stasis ulcers that showed no response to standard wound care. (19) The second concluded that hyperbaric oxygen enhanced the healing of ischemic, non-healing diabetic leg ulcers and may be used as a valuable adjunct to conventional therapy when reconstructive surgery is not possible. (20) On the other hand, authors supporting its use only in extraordinary circumstances as a useful adjunct in the treatment of some life- or limb-threatening situations where it can be cost effective. (21) Also, Jain et al, 2004 reported that HBO will remain an important adjunct to wound healing but its role needs to be redefined. (12)

10-Conclusions Oxy-Therapy is a beneficial adjuvant therapy that: •Accelerates the rate of wound healing, •Preserves a functional extremity, •Reduces the need for Amputation, and •Increases the rate of complete healing of bad ulcers on long-term therapy Ozone Therapy: Highly effective treatment of bad healing ulcers Improves some systemic disorders present in those patients Enhances the sense of wellbeing Hyperbaric Oxygen Therapy: Valuable for treating Selected cases of diabetic foot complications and impaired wound-healing. (Hypoxic) Combined Modality More beneficial in Selected cases (Hypoxia, infection, edema) Costly Recommendations From this pilot study we conclude that Adjuvant HBO and Ozone Therapy increased healing rates of chronic leg ulcers which did not respond to standard wound care and conventional methods of therapy, even in the presence of significant and severe co morbidities and challenges. We also support many recommendations that the role of HBOT and Ozone Therapy should be redefined by good randomized controlled studies to improve the level of evidence supporting their use in the management of venous ulcers and the cost effectiveness of its use.

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Revista Española de Ozonoterapia, vol. 1, nº 1. pp. 44-53, 2011

Aspectos prácticos en ozonoterapia:
Comprobación de la concentración de ozono generada /tiempo de vida media del gas en la jeringuilla
A pesar de los avances alcanzados en la aplicación médica del ozono, algunos aspectos relacionados con la manipulación clínica de este gas no han sido esclarecidos o estudiados con profundidad. El presente trabajo aplicó un método espectrofotométrico simple para el control de la concentración del ozono que proviene de un generador médico. Además se estudió el tiempo de vida media del ozono dentro de una jeringa ubicada en diferentes posiciones. Se demostró como realizando lecturas espectrofotométricas (240 nm) y mediante cálculos matemáticos (que toman en consideración la temperatura y presión ambiental de trabajo) se puede determinar la concentración de ozono que emite el generador de uso clínico, en caso de sospechar que no funciona adecuadamente o que no esté correctamente calibrado. Adicionalmente se demuestra la importancia de usar el gas en los primeros 10 min después de ser generado, en los cuales se pierde el 10% de la dosis inicial. También se comprobó que la posición en que se coloca la jeringuilla, aunque si es aconsejado tenerla con el cono hacia arriba, no es determinante en el manejo del gas.

Practical aspects of ozone therapy: Checking the generated ozone concentration / average lifetime of gas in the syringe.
Despite the current advances in the medical uses of ozone, some aspects of the clinical handling of this gas have not been clarified and studied property. The present work applies a spectrophotometric method for controlling the concentration of the medical ozone generator. In addition we studied the half life time of the ozone inside a syringe located at different positions. As was demonstrated by performing spectrophotometric measurement (240nm) and by mathematical calculations (taking into account working temperature and pressure) is possible to know the concentration of ozone generated by ozone devices for clinical use. This method is useful in case of doubt about the right functioning of the device or if it suspected a loss of calibration. Additionally, it was demonstrate the importance of using O3 in the first 10 min after being generated, because the loses of the10% of the initial dose. Also it was found that the position, in which the syringe is placed, even if advised to have it with the cone up, is not decisive in handling the gas.

1. Introducción Durante experimentos en una instalación para la electrificación, en 1975, el físico holandés Mak Van Marumom, descubrió que al pasar un arco eléctrico a través del aire aparecía una sustancia gaseosa con olor característico, que poseía fuertes propiedades oxidantes. En 1840 el profesor de la universidad de Basilea (Suiza), Cristian Frederick Schonbein relacionó los datos de los cambios con las propiedades del oxígeno y la formación de un gas en particular, al cual llamó ozono (de la palabra griega ozein “oloroso”). Schonbein detectó por primera vez la capacidad del ozono para unirse con sustratos biológicos en las posiciones correspondientes a los dobles enlaces. 1 La utilidad de la ozonoterapia en el tratamiento de diversas patologías se ha ido consolidando en el tiempo. A manera de ejemplo, dos estudios recientes de meta-análisis que aportan una fuerte evidencia científica, demuestran que la ozonoterapia en el tratamiento de la hernia discal, es tan eficiente como la cirugía, pero con un índice mucho menor de eventos adversos y también enormes ventajas en cuanto a los costos. 2,3 No obstante los avances alcanzados en está práctica médica, algunos aspectos relacionados con la manipulación clínica de este gas no han sido esclarecidos o estudiados con profundidad. El objetivo del presente trabajo fue aplicar un método espectrofotométrico simple para el control de la concentración del ozono que proviene de un generador médico y estudiar el tiempo de vida media del ozono dentro de una jeringa ubicada en diferentes posiciones. Materiales y métodos El ozono (mezcla O2/O3) se obtuvo de un generador OzonosanAlpha Plus (Alemania) a partir de oxígeno médico. El generador tiene incorporado un espectrofotómetro interno. Para el cálculo del tiempo de vida media y la comprobación del generador se utilizó un espectrofotómetro externo de simple haz y lámpara de deuterio (LKB, Alemania) ajustado a 254 nm. Medición de la concentración de ozono: Se tomaron muestras de ozono ajustando el equipo a diferentes concentraciones. Las muestras recogidas en una jeringuilla se inyectaron de manera inmediata en una cubeta de cuarzo de 1 cm, se tapó y se leyó la densidad óptica a 254 nm contra blanco aire. Los experimentos se repitieron 5 veces por cada concentración analizada. Partiendo de los valores de densidad óptica y el coeficiente de extinción molar del ozono (3000 M-1. cm-1 a 273,15 K y 1,103 •105Pa)4,5 se realizaron los cálculos de la concentración real de ozono. Se calcularon los porcentajes de desviación de las diferentes concentraciones obtenidas con respecto a las que indicaba el control interno del equipo. Los cálculos se basaron en la fórmula de Lambert-Beer, donde: C= D.O./ε•L, siendo: D.O., densidad óptica; ε, coeficiente de extinción molar del ozono (3000 M-1. cm-1) y L, paso de luz de la cubeta (1 cm). Se consideraron las modificaciones que ejercen sobre el coeficiente de extinción la temperatura y la presión. C= (D.O./ε•L) • (PNTP/P)• (T/TNTP) , siendo: PNTP, la presión normal (1,103 •105Pa), P la presión a la que se hacen las mediciones; TNTP (Temperatura normal, 273,15 K), y T la temperatura a la cual se realizó el experimento (20 ºC = 273,1 K).
Para los cálculos, se multiplicó la concentración en (mol/L) por el factor de conversión 48.000 mg/mol para obtener la concentración de ozono en μg/mL. Estudio del tiempo de vida media de la mezcla O2/O3 en una jeringuilla: Una jeringuilla plástica cono Luer central reutilizable de 50 mL se cargó con una concentración conocida de O2/O3 (20 μg/mL) y se colocó con el cono hacia arriba o hacia abajo con el auxilio de un soporte universal. A tiempo cero y cada 10 min se vertió en una cubeta de cuarzo de 1 cm, 3 mL del contenido de la jeringuilla y se midió la densidad óptica a 254 nm en el espectrofotómetro contra blanco aire. La cinética se siguió por 30 min. Los experimentos se repitieron 5 veces. Se calculó la variación de la concentración en el tiempo, el tiempo de vida media y el tiempo en que se degrada el 90% de la concentración inicial. Se registró la temperatura y la presión de trabajo, que durante el tiempo del estudio se mantuvieron constantes. Procesamiento estadístico de los datos: El análisis estadístico se inició con la prueba preliminar OUTLIERS para detectar los valores aberrantes. Se calcularon diferentes parámetros descriptivos para las variables analizadas (media y coeficiente de variación). Después se empleó el método ANOVA (una cola) seguido por la prueba de homogeneidad de varianza (Levene) y la prueba de comparación múltiple (Rangos de Duncan). El nivel de significación estadístico empleado en todos los casos fue como mínimo de p < 0,05. Para el estudio de la relación existente entre los valores de concentración y densidad óptica se utilizó el análisis de regresión y correlación lineal. Se tomó en cuenta, para validar la aceptabilidad del modelo escogido, los valores obtenidos para la prueba Durbin-Watson en el análisis de residuos. Se reportó el coeficiente de correlación de Pearson. Los datos se procesaron utilizando el paquete estadístico STATISTICA (versión 6) para WINDOWS. Resultados y discusión Los resultados de las mediciones de la densidad óptica de diferentes muestras de ozono y los cálculos de las concentraciones se recogen en la tabla 1. Tabla 1. Concentraciones calculadas de ozono y su variación con respecto al valor teórico.
Como se puede apreciar en la tabla, las variaciones de la concentración que se establecieron en el equipo con respecto a aquellas calculadas mediante el método espectrofotométrico no superan un 10 % (valor medio de la desviación encontrada 3,95 %). Debido a las diferentes fuentes de error del propio método fotométrico, para establecer las concentraciones del ozono, se ha establecido que este tiene una variación de un 10 % con respecto al valor de concentración real. 4 Por lo anterior, una desviación de un 10 % podría ser el límite aceptado para considerar la precisión del equipo. Un problema desde el punto de vista práctico, sería analizar concentraciones de ozono por encima de 40 μg/mL (si el espectrofotómetro no es capaz de detectar una absorbancia mayor de 3), para ello serían necesarias diluciones. Una variante para una dilución gaseosa, sería por ejemplo mezclar 5 mL de oxígeno y 5 mL del ozono, tomando en cuenta el factor de dilución para los cálculos finales.
Aunque los equipos generadores de ozono son calibrados por los fabricantes y deben ser certificados con cierta periodicidad, para garantizar las dosis requeridas en la terapia, 6 el método U.V. propuesto puede servir de apoyo ante cualquier incerteza o para comprobar el funcionamiento en condiciones de presión o temperatura particulares. En general un espectrofotómetro es un equipo común en los laboratorios clínicos de los hospitales. Debe tenerse en consideración que para hacer las mediciones el equipo generador debe estar cerca del espectrofotómetro, de manera que entre la toma del gas y la lectura de la absorbancia trascurra el menor tiempo posible. Es también importante que el espectrofotómetro con que se trabaja esté debidamente calibrado.
La concentración de ozono llegó a un 50 % de la concentración inicial a los 32 min en las jeringuillas que se colocaron boca arriba y 30 min en las colocadas boca abajo. La concentración se redujo en un 10 % con respecto a la concentración inicial a los 10 min en las que se colocaron boca arriba y 9 min en las colocadas boca abajo. Tanto para los cálculos de degradación de un 50 % o 10% no se encontraron diferencias significativas (p<0,05)entre las dos variantes de posiciones de las jeringuilla usadas. Las líneas finas representan las rectas de ajuste lineal. Para las jeringuillas posicionadas boca arriba la ecuación de la recta fue: Porcentaje de degradación = 72,44 • Tiempo – 0,703 (r= – 0,979) y para las colocadas boca abajo: Porcentaje de degradación = 70,02 • Tiempo – 0,663 (r= -0,990). Cada punto representa la media de 5 determinaciones con un coeficiente de variación (representado en las líneas de error) inferior al 5%. La densidad del ozono es de 2,14 kg • m-3 (a 273,1 K y 1,103 •105Pa), 7 siendo más denso que el aire que en igualdad de condiciones tiene una densidad de 1,29 kg • m-3. Lo más frecuente en la práctica médica es trabajar con líquidos inyectables. El trabajo con gases que no son visibles al ojo humano implica el conocimiento de otros aspectos como es el caso de la densidad de los gases. En la práctica, al ser el ozono más denso que el aire, tiende a ocupar la posición inferior. Por tanto, colocar las jeringas con el cono hacia abajo favorece la pérdida de ozono. En el experimento descrito en la figura 1, podemos observar que probablemente al originar el cono de la jeringuilla una reducción del flujo (por ser este muy estrecho, 1,52 mm), no se aprecian diferencias significativas en cuanto a la pérdida del ozono, con relación a la posición en que se coloque la jeringuilla. Por otra parte, es de destacar que en unos 10 min la dosis presente en la jeringuilla, en las condiciones ambientales de trabajo, se reduce en un 10 % (quedando un 90 % de la dosis inicial). Lo anterior ratifica el hecho de que el ozono se debe aplicar al paciente en un tiempo muy breve, desde el momento en que es generado. 8,9 El presente trabajo muestra cómo de una manera simple y con el empleo de un método espectrofotométrico, se puede controlar la concentración de ozono que emite el generador de uso clínico, en caso de sospechar que no funciona adecuadamente o que no esté correctamente calibrado. Adicionalmente se demuestra la importancia de usar el gas en los primeros 10 min después de ser generado y que la posición en que se coloca la jeringuilla, aunque si es aconsejado tenerla con el cono hacia arriba, no es determinante en el manejo del gas. Bibliografía. 1. Schwartz A, Martínez-Sánchez G. Ozone Therapy and Its Scientific Foundation. Revista Española de Ozonoterapia 2012; 2(1): 163-198. 2. De Oliveira Magalhaes FN, Dotta L, Sasse A, Teixera MJ, Fonoff ET. Ozone Therapy as a Treatment for Low Back Pain Secondary to Herniated Disc: A Systematic Review and Metaanalysis of Randomized Controlled Trials. Pain Physician 2012 Mar;15(2):E115-29. 3. Steppan J, Meaders T, Muto M, Murphy K J. A meta-analysis of the effectiveness and safety of ozone treatments for herniated lumbar discs. J VascInterv Radiol 2010; 21: 534-548. 4. Delgado, M. Ozone concentration measurements. State of the art. Revista Espanoloa de Ozonoterapia 2001. 5. Kerwin Raknessl, Gilbert Gordonz, Bruno Langlaiss, et al. Guideline for Measurement of Ozone Concentration in the Process Gas From an Ozone Generator. Ozone Science and Engineering 1996;18:209-229. 6. Re L, Malcangi G, Martinez-Sanchez G. Medical ozone is now ready for a scientific challenge: current status and future perspectives. J ExpIntegr Med. 2012; 2(3): 193-196. doi:10.5455/jeim.070612.ir.012 7. Menéndez Cepero, Silvia et al. Ozono Aspectos Básicos y Aplicaciones Clínicas. Centro de Investigaciones del Ozono, La Habana, Cuba. Ed. CENIC ISBN 959-7145-06-5. (2008). 8. Achwartz Adriana, Claudia Nikolaevna Kontorschikova, Oleg Vitorovich Malesnoko, Gregorio Martínez Sánchez, Lamberto Re, Irina Avenerovna Gribkova. “Guía para el uso médico del ozono – Fundamentos terapéuticos e indicaciones”, AEPROMO, 2011, 315 p. + XVIII + 11 p. láminas de color. ISBN: 978-84-615-2244-6 9. AEPROMO, Madrid Declaration on Ozone Therapy, in International Meeting of Ozone Therapy Schools, Madrid, Spain, 2010. [Consultado 17/01/2013] http://www.aepromo.org/declaracion_madrid/Declaracion_madrid.pdf

Efectos del aceite ozonizado en la Conjuntivitis Hemorrágica Epidémica

Ozone, conjunctivitis hemorrágica epidémica, conjunctiva, Oleozon, aceites ozonizados.

La Conjuntivitis Hemorrágica Epidémica (CHE) es una inflamación conjuntival de etiología viral, autolimitada que afecta a todas las edades y cursa de forma epidémica. Sus síntomas fundamentales son sensación de cuerpo extraño, lagrimeo, fotosensibilidad, malestar general y dolor. Sus signos críticos son hemorragias subconjuntivales, reacción folicular y adenopatías pre auriculares. También se observa secreción serosa, quémosis, queratitis superficial punteada y ptosis palpebral. Teniendo en cuenta el poder germicida de amplio espectro del OLEOZON (aceite de girasol ozonizado), así como su cierto carácter antiinflamatorio, el objetivo de este trabajo fue evaluar la efectividad de este medicamento en su forma de colirio para el tratamiento de la CHE. En el Hospital Docente ¨Dr Salvador Allende¨ fueron atendidos 20 pacientes con CHE en Octubre del 2009. De ellos 12 recibieron tratamiento con OLEOZON colirio (1 gota dos veces al día) y 8 conformaron el grupo control los cuales recibieron tratamiento convencional (fomentos fríos, antinflamatorios no esteroideos, yodoxuridina en colirio ó interferón alfa-2b recombinante). Todos los pacientes tratados con OLEOZON tuvieron una rápida evolución hacia la curación. A las 72 h mostraban signos de gran mejoría y a la semana estaban totalmente curados. Ninguno de los pacientes presentó complicaciones. En el grupo control la evolución fue más prolongada, fundamentalmente en los pacientes que presentaron complicaciones (3 con queratitis). El tratamiento de la CHE con OLEOZON colirio brinda resultados muy positivos en esta patologia

Clinical experience in the treatment of Epidemic Hemorrhagic Conjunctivitis with OLEOZON collyrium

Ozone, Epidemic Hemorrhagic Conjunctivitis, conjunctiva, OLEOZON, ozonized oil.

Epidemic Hemorrhagic Conjunctivitis (EHC) is a self-limited, conjunctiva inflammation of viral etiology which affects all ages and takes place in epidemic form. Its main symptoms are sensation of foreign bodies, lacrimation, photosensitivity, general discomfort and pain. Its critical signs are subconjunctival hemorrhages, follicular reaction and pre-auricular adenopathy. Also, serous secretion, chemosis, superficial punctate keratitis and palpebral ptosis are observed. Taking into account the broad spectrum germicide power of OLEOZON (ozonized sunflower oil), as well as its degree of anti-inflammatory character, the aim of this study was to evaluate the effectiveness of this medication in its collyrium form for the treatment of EHC. In ¨Dr. Salvador Allende¨ Clinical Hospital, 20 patients were treated with EHC in October, 2009. Twelve of them received treatment with OLEOZON collyrium (one drop twice per day) and 8, making up the control group, received conventional treatment (cold compresses, non steroidal antiinflammatory drugs, yodoxuridine in collyrium or recombinant alfa-2b interferon). All patients treated with OLEOZON underwent a fast evolution toward recovery. In 72 h, they showed signs of great improvement and in 1 week they were totally cured. No patients presented complications. In the control group the evolution was more prolonged, mainly in patients showing complications (3 with keratitis). Treatment of EHC with OLEOZON collyrium provides with very positive results in this disease.

Introducción.

La Conjuntivitis Hemorrágica Epidémica es una enfermedad viral, infecciosa muy contagiosa, que presenta frecuentes brotes epidémicos con rápida diseminación entre los colectivos, con períodos cortos de incubación y con evolución aproximada de 10 días. Se reporta su aparición en 1969 en países como Ghana (con el nombre de Apolo 11), en la India, Inglaterra y países asiáticos. En el hemisferio occidental se presentó por vez primera en 1981, y en Cuba en ese mismo año siendo en esta ocasión el Enterovirus 70 el causante. Los virus Enterovirus 70 y Coxackies A-24 son los responsables de millones de casos ocurridos en estos últimos 20 años. El Coxackies A24 produce un cuadro clínico de moderado a severo, presentando hemorragia subconjuntival solo el 6%. Presenta una recuperación completa de 1 a 2 semanas, teniendo como complicación mas frecuente una sobre infección por bacterias siendo el Staphyloccocus aureus como agente más implicado. En el Enterovirus 70 el cuadro clínico es más aparatoso, apareciendo la hemorragia subconjuntival en el 28 al 100% de los casos. La complicación que más frecuente se presenta en estos pacientes es la Queratitis subepitelial transitoria por invasión del virus a la córnea, cuya recuperación puede ser de 10 días hasta semanas con un tratamiento enérgico adecuado para combatir esta complicación. El cuadro clínico de la conjuntivitis hemorrágica epidémica se caracteriza por edema parpebral, secreciones serosas o mucoides, ocasionalmente sanguinolentas, hemorragia subconjuntival que inicialmente pueden ser petequias confluyendo posteriormente y tomando disposición en forma de sábanas. También pueden presentarse ocasionalmente adenopatías preauriculares. Entre los síntomas presentes están: sensación de arenilla, visión borrosa, dolor ocular y fotofobia y como síntomas generales puede acompañarse de fiebre, malestar general, mialgias y síntomas respiratorios. Los aceites de origen vegetal se han convertido en vehículos adecuados para la terapéutica con ozono. En este sentido el más comúnmente utilizado es el aceite de oliva. El carácter germicida del aceite de oliva ozonizado fue comprobado utilizando Staphylococcus aureus4 como modelo experimental obteniéndose, después de aproximadamente 13 horas, un 99 % de muerte del microorganismo. Como control se escogió el aceite de oliva no ozonizado y se pudo observar crecimiento significativo en este grupo. Existen otros estudios microbiológicos y químicos sobre el aceite de oliva ozonizado,5,6 así como experiencia en aplicaciones clínicas del mismo en el tratamiento de la vulvovaginitis, impétigo, sinusitis agudas y crónicas, forunculosis, queratosis senil; y en la Medicina Veterinaria por su acción bacteriana, fungicida y virucida.7,8 Al ozonizar los aceites vegetales, se obtiene una serie de compuestos químicos (ácidos, aldehídos, ozónidos y peróxidos) los cuales poseen un carácter germicida haciéndolo útil para el tratamiento de heridas infectadas, fístulas y otros procesos sépticos locales. Además, estos peróxidos desempeñan varias funciones en el organismo que incluyen:9 estimulación de varios sistemas enzimáticos de óxido-reducción, por lo que influyen positivamente sobre el transporte de oxígeno a los tejidos y en la cadena respiratoria mitocondrial; bloqueo de los receptores virales y muerte de células infectadas por virus, así como un efecto sinérgico de reforzamiento de la capacidad fagocitaria. En el Centro Nacional de Investigaciones Científicas (CNIC) se realizó un estudio sobre la sustitución del aceite de oliva por el aceite de girasol. Ambos aceites ozonizados fueron evaluados por su poder microbicida, utilizando como modelo experimental, el crecimiento de la especie de levadura Cándida tropicalis. Se emplearon como controles los aceites sin ozonizar. Los resultados mostraron la factibilidad del empleo del aceite de girasol con ventajas económicas sobre el aceite de oliva. Además se comprobó que los aceites sin ozonizar no producían inhibición del crecimiento de esta levadura.10 El aceite de girasol ozonizado (OLEOZON) es un líquido oleoso, algo viscoso, de color amarillo claro y de olor característico, de aspecto lechoso, libre de materiales sólidos. Es una mezcla compleja, fundamentalmente formada por triglicéridos insaturados, triglicéridos modificados con funciones ácidas y aldehídos, hidroperóxidos, ozónidos y agua en emulsión. Además de sus ventajas económicas ha pasado satisfactoriamente pruebas preclínicas de irritabilidad dérmica y oftálmica, estudios de toxicidad aguda, ensayos de mutagenicidad y teratogenicidad,11,12 los cuales garantizan la inocuidad del mismo. También se realizaron estudios in vitro que demostraron la acción antibacteriana del OLEOZON.13 Desde fines de 1986, se vienen realizando diferentes investigaciones sobre las posibilidades terapéuticas del OLEOZON en diversas enfermedades.14-25 El OLEOZON tópico esta registrado en Cuba para el tratamiento de la epidermofitosis y el impétigo26,27 y el OLEOZON oral para la giardiasis.28 Teniendo en cuenta el carácter germicida de los aceites vegetales ozonizados, el objetivo general de este estudio fue evaluar la efectividad del OLEOZON colirio en el tratamiento de la conjuntivitis epidémica y como objetivos específicos los siguientes: 1. Identificar la respuesta al tratamiento de los pacientes tratados con OLEOZON colirio y con tratamiento convencional. 2. Identificar características clínicas basales y evolutivas de los pacientes tratados con OLEOZON colirio y con tratamiento convencional. 3. Evaluar los posibles efectos adversos con la aplicación de ambos tratamientos…

Pacientes y Método.

Se realizó un estudio epidemiológico, observacional, descriptivo, longitudinal y prospectivo en el Centro Oftalmológico Dr. Salvador Allende, La Habana, Cuba, cuyo universo estuvo conformado por la totalidad de los pacientes que acudieron al mismo con diagnóstico confirmado de conjuntivitis hemorrágica epidémica en el período entre septiembre y octubre 111 de 2009. Se seleccionó una muestra aleatorizada de los primeros 20 de estos que cumplían los criterios de inclusión y exclusión. Criterios de inclusión: 1. Pacientes entre 18 y 59 años. 2. Pacientes que en el momento del examen inicial no tenían complicaciones del segmento anterior. 3. Aceptación de participar en el estudio. Criterios de exclusión: 1. Pacientes con otra enfermedad ocular o sistémica, aguda o crónica. 2. Pacientes con el antecedente de ingestión de drogas antiagregante plaquetaria en a semana anterior a la inclusión. 3. Pacientes con más de 24 horas de instalada la enfermedad. La muestra se conformó de la siguiente manera: Doce pacientes con tratamiento de OLEOZON colirio y fomentos frescos y 8 pacientes con tratamiento convencional (fomentos frescos de suero fisiológico, Yodoxuridina, Tropicamida, Antiinflamatorio no esteroideo cada 8 horas, Interferón Alfa 2B recombinante una gota cada 8 horas. Los pacientes fueron distribuidos en dos grupos de acuerdo a una tabla de números aleatorios, mediante un programa computarizado. Primer grupo: incluyó 12 pacientes que fueron tratados con 2 gotas oculares de OLEOZON, una vez por día, la que se aplicaba por los investigadores, durante 7 días. Segundo grupo: Incluyó 8 pacientes que fueron tratados con el tratamiento convencional de esta enfermedad, con base en el empleo local de interferón recombinante y sistémico y además antinflamatorios sistémicos no esteroideos durante 7dias. Se tomaron medidas generales como aislamiento del paciente, medidas higiénicas sanitarias y tratamiento sintomático. Se llenaron los documentos de Consentimiento Informado en conformidad al tratamiento y el de enfermedad de Declaración Obligatoria. Ambos grupos tuvieron seguimiento clínico diario hasta la remisión completa de la enfermedad, con el objetivo de identificar reacciones adversas al tratamiento indicado. Los pacientes tuvieron un seguimiento total de 10 días. Diariamente se le realizaban examen biomicroscópico con lámpara de hendidura para el examen de segmento anterior. El estudio se llevó a cabo siguiendo las recomendaciones recogidas en la Declaración de Helsinski (1964), en la revisión adoptada por la 52ª Asamblea General de Edimburgo, Escocia (octubre de 2000). En todos los casos incluidos en la serie se obtuvo previamente el consentimiento informado de cada paciente. ««Mirta Copello Noblet, Silvia Menéndez, Adriana Schwartz Tapia Revista Española de Ozonoterapia, vol. 2»»

Criterios de Evaluación Nos basamos en cuatro síntomas y un signo los cuales son: edema parpebral, hemorragia subconjuntival, secreciones, adenopatía preauricular y sensación de arenilla.

Edema parpebral: 5 mm (Altura de la hendidura interparpebral) 7mm 10 mm

Hemorragia subconjuntival: Conjuntiva bulbar afectada totalmente (afectación) Conjuntiva bulbar superior Conjuntiva perilímbica

Secreciones: Mucoserosas, Lagrimeo, Ausente.

Adenopatía preauricular: Presente y dolorosa, Presente e indolora Ausente.

Sensación de arenilla: Intensa Moderada, Ausente.

Criterios de mejoría a las 72 horas y a los 7 días

Significativos: Edema parpebral: Mejoría significativa: de 7 a 10 mm Hemorragia subconjuntival : Perilímibica Secreciones: Ausente Adenopatía preauricular: Ausente Sensación de arenilla: Ausente

Bueno: Edema Parpebral: de 4 a 6mm Hemorragia subconjuntival : Conjuntiva bulbar superior Secreciones: Lagrimeo Adenopatía preauricular: Presente e indolora Sensación de arenilla: Moderada.

Regular: Edema Parpebral: de 1 a 3mm Hemorragia subconjuntival : Presencia de inyección ciliar Secreciones: Mucoides Adenopatía preauricular: Presente e indolora Sensación de arenilla: Moderada.

Malo: Edema Parpebral: de 1 a 3mm Presencia de inyección ciliar Secreciones: seromucoides Adenopatía preauricular: Presente y dolorosa Sensación de arenilla: Moderada Dolor intenso.

Efectos adversos. Se consideró el escozor cuando se aplicaban ambos tratamientos, siendo este más acentuado cuando se utilizaba el aceite ozonizado. Lo anterior se debe a que el pH de los colirios es cercanos al pH lagrimal (7,45), mientras que el del aceite ozonizado es ~5. También debido a su carácter oleoso permanece más en contacto con la superficie ocular inflamada. Visión borrosa aproximadamente una hora en aquellos pacientes tratados con Oleozon debido a la presencia de la película oleosa en la superficie corneal.

Mecanismos de acción germicida. El OLEOZON puede atacar grupos sulfhídrilos de hongos y bacterias. Estos grupos sulfhídrilos se encuentran unidos a proteínas, los cuales cuando son atacados por los productos del OLEOZON se oxidan, dañándose la estructura de la proteína ocurriendo su posterior degradación. Si esta proteína se encuentra unida al ADN del agente biológico (bacteria, hongo o virus), este sufre daño, el cual puede ser irreversible. Además, si esta proteína es una enzima vital del germen (hongo, bacteria o virus) se afecta el ciclo de vida del agente biológico y su crecimiento, quedando inhibido o muerto.28-35 Por otra parte, se conoce que el OLEOZON provoca toxicidad sobre el agente biológico, oxidando componentes de membrana, modificando la estructura molecular del receptor por lo que no puede reconocer a la célula a la cual va a parasitar. Ha sido ampliamente publicado que en caso de los virus, que los productos del OLEOZON (ácidos, aldehídos, hidroperóxido, ozónidos) atacan a la N-acetil glicosamida, molécula por la cual varios virus se anclan a la célula, por lo que el virus no puede anclarse a la célula y la inhibe.28-35 De forma general los aceites vegetales ozonizados tienen efectos in vitro ya estudiados y publicados que aportan un posible mecanismo germicida directo, sobre agentes biológico (hongos, virus, bacterias) estos son:36-38 1-Oxidación directa de biomoleculas presentes en membranas, capside, etc. 2-Degradación del ADN (bacteriano, fúngico y posiblemente viral). 3- Ataque directo a grupos sulfhídrilos presentes en proteínas de membranas, asociadas al ADN, o formadoras de canales de sodio y/o potasio. 4- Los compuestos presentes en los aceites ozonizados provocan un ambiente de estrés oxidativas para los agentes biológicos (virus, bacterias, protozoo, hongos) .Dicho ambiente no es soportado por estos agentes ya que los mismos no cuentan con una capacidad antioxidante, por lo que se inhiben deteniéndose su crecimiento y a veces mueren.

Conclusiones.

Debido al gran carácter germicida del OLEOZON colirio se logró una evolución más rápida hacia la curación en los pacientes aqejados de la conjuntivitis Hemorrágica Epidémica comparado con el Grupo control.

Referencias.

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Effect of ozone therapy on redox status in experimentally induced arthritis

M.Nabil.Mawsouf Ozone Therapy Unit, National Cancer Institute, Cairo University, Egypt Maha.M. El-Sawalhi, Hebatalla A. Darwish, Amira A. Shaheen Biochemistry Department, Faculty of Pharmacy, Cairo University, Egypt G. Martínez-Sánchez CEIEB-IFAL, University of Havana, Cuba Lamberto Re Pharmacology, D.I.S.M.A.R., University of Ancona, Italy.

Abstract: Controlled ozone administration has been shown to promote an adaptation to oxidative stress by increasing endogenous antioxidant systems. In the present study, the effects of O2/O3 administration either prophylactically or therapeutically on the alterations of oxidant status in adjuvant-induced arthritis in rats have been studied. Seven groups of rats were used: 1) normal control group; 2) control arthritic group (21 days); 3) pro- phylactic ozone group: arthritic rats received fifteen intra-rectal applications of O2/O3 at 0.5, 0.7 and 1 mg/kg b.w. in a 5-6 mL volume starting one day before adjuvant in- oculation and continued as five applications/week over 21 days; 4) oxygen group: re- ceived oxygen (vehicle of ozone) in a similar schedule to group 3; 5) control arthritic group (24 days); 6) therapeutic-ozone group: arthritic rats received 10 intra-rectal ap- plications of O2/O3 at 0.5, 0.7 and 1 mg/kg b. w. in a 5-6 mL volume daily for 10 days starting fourteen days after adjuvant inoculation; 7) oxygen-treated group: received oxygen in a similar schedule of group 6. The effect of O2/O3 administration was as- sessed by measuring: blood glutathione (GSH), erythrocyte glutathione peroxidase and catalase activities, serum levels of protein thiols (PrSH), malondialdehyde (MDA) and nitrite/nitrate (NO2/NO3), as well as serum ceruloplasmin activity (CP). The pres- ent study showed that adjuvant-induced arthritis in rats caused a significant (p0.05) reduction in blood GSH, serum PrSH levels and erythrocyte antioxidant enzyme ac- tivities accompanied by a significant (p0.05) increase in serum levels of MDA, NO2/NO3 and CP activity. Ozone administration either prophylactically or therapeuti- cally normalize blood GSH, serum PrSH and MDA levels and restored erythrocyte na- tioxidant enzyme activities. However ozone did not significantly (p>0.05) modify sérum
NO2/NO3 level in induced rat but significant (p>0.05) increase CP activity. So it could
be concluded that O2/O3 oxidative preconditioning / postconditioning effectively mod-
ulate the antioxidant/oxidant balance associated with adjuvant arthritis model in rats.

Sugerencia sobre cómo citar este artículo: M.Nabil.Mawsouf, Maha.M. El-Sawalhi, G. Martínez-Sánchez, Hebatalla A. Darwish and Amira A. Shaheen, L. Re. (2011). Effect of ozone therapy on redox status in experimentally induced arthritis. Revista Española de Ozonoterapia. Vol.1, nº 1, pp. 32-43.

Introduction:
Ozone therapy as a complementary medical approach has been known for more than four decades. The main areas where that kind of treatment could be useful include resistant infectious diseases, autoimmune diseases, neurodegenerative diseases, orthopedic pathologies and vascular disorders1 . With the advent of precise medical ozone generator, currently ozone therapy have been marked with growing recognition of the use of appropriate and judicious doses making this therapy useful with valuable biological effects2. The use of calculated, standardized ozone doses has been found to induce a transient acute oxidative stress condition which is not deleterious but is capable of eliciting a multiple useful biological responses. The effect could be seen in activation of antioxidant defense system, improvement of circulation, oxygen delivery, and trophic processes in tissues as well as enhancement of autocoids, growth factors and cytokine release3. Several experimental studies have demonstrated that controlled ozone administration could bring about a state of ozone oxidative preconditioning (O3OP) or adaptation to oxidative stress, preventing the damage caused by reactive oxygen species (ROS) generated in various experimental models. These include; carbon tetrachloride-induced hepatotoxicity4, hepatic ischemia-reperfusion injury5, cisplatin-induced acute renal failure6 , chronic renal failure induced by subtotal nephrectomy7 and streptozotocin-induced diabetes in rats8. More recently is also demonstrated that the oxidative postconditioning can be cytoprotective in different experimental model of diseases9 , 10 . Experimental arthritis induced by adjuvant is an experimental model of systemic inflammatory autoimmune disease that shares many features with human rheumatoid arthritis. It involves most of the joints and associated tissues11 . Although the etiology of rheumatoid arthritis is not fully elucidated, autoimmune destruction of the affected tissues plays a pivotal role in the incidence and progression of the diseases12. In addition excessive generation of free radicals and formation of lipid peroxide in target tissues of inflammation are, also, considered as the most common factors implicated in tissue damage in rheumatoid arthritis13 and experimental arthritis14 . Thus, a state of oxidative preconditioning such that achieved with controlled ozone therapy may potentially be able to readjust the redox imbalance in adjuvant arthritis and attenuate the progression of the disease. The aim of the current work was to investigate the role of ozone, as prophylactic or therapeutic agent, in correcting the redox imbalance and the biochemical changes associated with adjuvant-induced arthritis in rats.

Materials and Methods:
Animals: Adult male albino rats of Wistar strain, 200-250 g weight were obtained from Egyptian Organization for Biological Products and Vaccines (Cairo, Egypt). Rats were housed in plexiglass cages, maintained in an air-filtered and temperature-conditioned (20 oC – 22 oC) room with a relative humidity of 50 % – 52 % and under an artificial light/dark cycle of 12 h. Animals were fed with standard laboratory chow and water ad libitum. Procedures involving animals and their care were conducted in conformity with the institutional guidelines that are in compliance with national and international (EEC Council Directive 86/ 609, OJL 358, 1, 12 December 1987; Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, US National Research Council, 1996) laws and policies. Chemicals: Complete Freund`s adjuvant (Difco laboratories, Detroit, USA) was used for induction of arthritis in rats. It consists of 0.05% heat killed Mycobacterium butyricum suspended in mineral oil. All other chemicals were of analytical pure grade supplied from Sigma-Aldrich St. Louis (USA). Ozone generation: Ozone was generated just before applied by ozone generator system [EXT120-T] (Longevity-resovces Inc., Canada – ETL approved for proven quality and safety). Ozone obtained from 34 Revista Española de Ozonoterapia, vol. 1, nº 1. pp. 32-43, 2011 Effect of ozone therapy on redox status in experimentally induced arthritis. medical grade oxygen represented about 0.4-0.5 % (1 µg/mL – 120 µg/mL) of the gas mixture. The ozone concentration was measured by using a build-in UV spectrophotometer at 254 nm.

Experimental design:
Induction of adjuvant arthritis: It was induced in rats by a single subcutaneous injection of 0.25 mL of complete Freund`s adjuvant into the palmer surface of the right hind foot pad15. The peak of adjuvant polyarthritis was reached after 14 days from adjuvant inoculation.
Ozone treatment :
Ozone was given by intra-rectal application using 20 mL silicone-coated disposable syringe and rectal catheter. Fixed volumes of the O3/O2 mixture were administered according to the animal weight so as to reach a final O3 dose. This route of administration was considered as most useful and easy procedure in rats16.

For studying the prophylactic or therapeutic effects of ozone on the adjuvant arthritis model, the arthritic rats were divided equally into six groups of eight rats each. The first (prophylactic O3/O2 group) received 15 intra-rectal applications of O3/O2 over three weeks starting one day before adjuvant inoculation. O3/O2 mixture was given as five applications per week. It was started with a relatively low dose of ozone as 0.5 mg/kg b.w. /day in the first week, increased to 0.7 mg/kg b.w./day in the second week and ended with 1 mg/kg b. w./day in the third week. The volume of O3/O2 mixture administered was 5-6 mL/rat according to the animal weight. The second arthritic group received oxygen only (as a vehicle for ozone) in a similar schedule to the first group. The third group of arthritic rats was kept without treatment throughout 21 days and served as a control (arthritic 21 days) for the above two groups. The fourth arthritic group (therapeutic ozone group) received 10 intra-rectal applications of O3/O2 mixture starting fourteen days after adjuvant inoculation. The treatment was started by a daily dose of 0.5 mg/kg b.w. for 3 days, followed by 0.7 mg/kg b.w. for another 3 days and ended with one mg/kg b.w. for 4 days. The volume of O3/O2 mixture administered was 5-6 mL/rat according to the animal weight. The fifth arthritic group received oxygen only 14 days after adjuvant inoculation in a similar way to the fourth group. The sixth arthritic group was kept without treatment throughout 24 days and served as a control (arthritic 24 days) for the fourth and fifth groups. A group of normal rats left without any treatment and served as a control (non arthritic) group for all the above groups. All the groups were kept under the same conditions during the whole experiment.

At the end of the experimental periods, the animals were sacrificed and the blood was collected in heparinized and non-heparinized tubes, an aliquot of heparinized blood was used to assay glutathione (GSH)17. Another aliquot of heparinized blood was lysed directly in ice cold distilled water (5% v/v) and used for the determination of catalase activity (CAT; EC 1.11.1.6)18. The remaining heparinized blood was centrifuged for 10 min at 3000 g for the separation of red cells used to measure the glutathione peroxidase activity (GPx; EC 1.11.1.9)19. On the other hand the non-heparinized blood was allowed to clot and the separated serum were used for the estimation of malondialdehyde (MDA)20, 21; protein thiols (PrSH)22 and nitrite/nitrate (NO2/NO3) levels23 as well as ceruloplasmin (CP) activity24.

Statistical:
Analysis Initially the OUTLIERS preliminary test for detection of error values was applied as a first step in the statistical analysis. After this, the homogeneity of variance test (Bartlett-Box) was used. Values are given as means ± SD. The level of statistical significance was taken at p

Results:
Blood antioxidant levels in arthritic rats subjected to prophylactic and therapeutic intra-rectal application of ozone: The results for these parameters are shown in table 1 and 2. Data demonstrated that 21 or 24 days after adjuvant inoculation, arthritic rats exhibited a significantt (p<0.05) reduction in blood GSH and serum PrSH levels. The reduction was extended, also, to include GPx and CAT activities as compared to the normal values.
Intra-rectal application of O3/O2 as prophylactic therapy (table1), caused a significant (p<0.05) elevation in blood GSH, serum PrSH, erythrocyte GPx and CAT activities as compared to the values present in arthritic animals. In the same way, therapeutic intra-rectal application of O3/O2 mixture (table 2) successfully restored these blood antioxidants to levels approaching or exceeding the normal values.
Serum levels of MDA and NO2/NO3 as well as CP activity in arthritic rats subjected to prophylactic or therapeutic intra-rectal application of ozone: As indicated in table 3 and 4,
adjuvant-induce arthritis caused a significant (p<0.05) increase in serum levels of MDA, NO2/NO3 and CP activity after both 21 or 24 days of adjuvant inoculation.
These data, demonstrated that prophylactic intra-rectal application of
O3/O2 mixture (table 3) normalize serum MDA
level of arthritic induced rats,
but failed to exert any change in serum NO2/NO3 level of these rats. Meanwhile,
O3/O2 pretreatment provided a further elevation of serum CP activity to a level exceeding the arthritic values. Therapeutic intra-rectal application of O3/O2 mixture (table 4) caused a significant (p<0.05) reduction in serum MDA level to approach the normal value, together with further elevation of CP activity than the arthritic levels. Meanwhile serum NO2/NO3 of arthritic rats was not significantly changed in response ozone treatment.
The results clearly showed that intra-rectal application of O2 (as a vehicle of O3) in prophylactic and therapeutic treatment did not affect any of the measured parameters compared to the values of arthritic rats.
Discussion:
The involvement of ROS in chronic inflammatory conditions such as rheumatoid arthritis and adjuvant induced-arthritis is well documented. ROS once generated provoke deleterious effects on various cellular components, among which are membrane lipids that are extensively subjected to peroxidation. Aggravation of arthritis was reported to be associated with enhancement of lipid peroxidation25.
In the present study, overproduction of ROS in adjuvant arthritis model leads to a considerable oxidant stress as indicated by a high serum level of MDA, a marker of lipid peroxidation, as well as consumption of blood antioxidants such as GSH and PrSH. The marked increase in serum MDA was observed in arthritic rats in line with our results; in arthritic rats model 26-28, and in rheumatoid arthritis patients29. Increased lipid peroxide in arthritic rats is exacerbated by the decline in blood antioxidants. Similar results about GSH were reported in arthritic rats model and rheumatoid arthritis patients respectively30, 31. In the same line, a marked decrease in GSH concentration was observed in the joint articular cartilage of arthritic rats32 . The reduction of GSH might be attributed to the increased consumption for counteracting oxidative stress during inflammation. Increased oxidative stress was reported to enhance the formation and efflux of glutathione disulfides33. Moreover, the observed reduction in serum PrSH is in line with previous studies30, 34. Such reduction could be attributed to the excessive consumption by peroxide35 and/or to a low serum albumin reported in other studies, since the greatest majority of serum SH (85- 90%) are found in albumin36.
In the current investigation, the decline in blood antioxidants was, also, extended to include erythrocyte GPx and CAT activities. The observation is consistent with previous manuscript 26 , 27 .Adefective antioxidant enzyme machinery had been observed in erythrocytes of rheumatoid arthritis patients37 and in liver, kidney and heart of adjuvant arthritic rats38. The increased production of superoxide anion, H2O2 and hydroxyl radicals demonstrated by Ramprasath et al. (2005)39 might be responsible for inhibition of GPx and CAT activities.
The role of NO and other reactive nitrogen species in inflammation has not been conclusively established. However, evidences for the implication of NO in the process of inflammation and that NOS inhibitors possess potential-anti inflammatory effects have been presented.
The present results revealed a significant (p<0.05) ) increase in serum NO level in arthritic rats (measured as total NO2/NO3). Such result is in line with previous reports27, 41 in arthritic rats and in rheumatoid arthritis patients42. The over expression of iNOS in arthritis might result from increased production of IL- 1 and other pro-inflammatory cytokines characteristic of that disease40.
Moreover, a major systemic event that happens in the rat following the induction of inflammation is the marked change in the level of serum CP, an acute phase protein43 . In the present study, a marked elevation in serum CP activity was observed. Such elevation is consistent with previous observations30 , 34 in arthritic rats. The increase in serum CP activity might be due to increase in its hepatic synthesis triggered by increased secretion of IL-1, epinephrine and glucocorticoids44. Furthermore, such an increase in CP activity has been reported to have a role in down regulating the inflammatory mediators and inhibiting the lipid peroxidation43.
In the present study, prophylactic intra-rectal application of O2/O3 to arthritic rats over three weeks exerted protective effects on some important blood antioxidants (GSH, PrSH, GPx and CAT) and preserved them to pre-arthritic values (table 1). The present data, demonstrated that therapeutic intra-rectal application of O2/O3 for 10 days after development of adjuvant arthritis attenuated the reduction in blood antioxidants and restored the levels of these defense constituents to values close to or above the normal ones (table 2). Moreover, these stimulant effects of O2/O3 therapy on blood antioxidants were accompanied by a decrease in serum MDA level to reach the normal levels (tables 3 and 4). These positive experimental observations could be explained at the light of the ozone abilities to up-regulate the antioxidant system, a state reached under controlled use of O2/O345. Ozone post or preconditioning is analogous to other phenomena such as ischemic preconditioning46, thermal preconditioning47, chemical preconditioning48, ischemic protconditioning10, 49. All of these processes have in common that a repeated and controlled stress is able to provide protection against a prolonged and severe stress.
A point that should not be overlooked is that O3 adaptation caused by judicious use of O3 is due to the fact that O3, instantaneously reacts with biomolecules generating ROS, among which are H2O2 and lipid peroxidation products (LOP). These molecules can elicit the up-regulation of antioxidant enzymes such as SOD, GPx, GSH-reductase and CAT. In bone marrow cells, particularly during erythrogenesis, submicromolar concentrations of LOP can up-regulate the synthesis of antioxidant enzymes2 . Interestingly, Iles and Liu50 have demonstrated that some LOP by inducing the expression of glutamate cysteine ligase cause an intracellular increase of GSH. These aforementioned findings might account for the generation of biochemically improved erythrocytes during prolonged O3 therapy. Erythrocytes have been shown to respond to O3 therapy with activation of glycolysis and pentose phosphate pathway51.
In the current study, up-regulation of erythrocytes GPx and CAT by O2/O3 might be responsible for the preservation of blood GSH and serum PrSH from oxidation by ROS in arthritic rats. Furthermore, the reported activation of pentose phosphate pathway might play a role in restoring GSH level from its oxidized form.
On the other hand, prophylactic and therapeutic rectal applications of O2/O3 therapy provided further elevation of serum CP activity than the arthritic levels (tables 3 and 4). That effect could be explained on the basis that O3 acts as a mild enhancer of immune system through activation of gene/regulatory nuclear factor kappa B (NF-κB) by H2O2, one of the major decomposition products of O3. Activation of that transcription factor switches on some genes that are responsible for the synthesis of several proteins, among which are the acute phase reactants and numerous interleukins52. The increased CP activity might reflect improved antioxidant status of animals subjected to O3 therapy. Moreover, O3-induced increase in CP activity could be beneficial to prevent against oxidative stress observed in adjuvantinduced arthritic rats.
In the present study, the remarkable enhancement of antioxidant status of arthritic rats has provided a protection against ROS and suppressed the process of lipid peroxidation leading to normalization of serum MDA level. Another point which should be considered in is the inability of O3 therapy to change the serum level of NO than was raised the arthritic induced rats; such effect might be related to the stimulatory effect of O3 on blood GSH. It has been stated that NO readily reacts with GSH and other cysteine containing compounds forming S-nitrosothiols with half lives of 5-50 min, in contrast to the very short half-life of NO53. Thus, formation of S-nitrosothiols in response to O3 therapy may allow more pharmacological effects at distant sites.
Conclusions It can be concluded that O2/O3 pre or postconditioning effectively improved the antioxidant/oxidant imbalance associated with adjuvant arthritis in rats. These results potentially support the use of ozone therapy as a complementary medical approach in rheumatoid arthritis. However, further studies are needed to verify the benefit of O3 therapy in rheumatoid arthritis at biochemical and clinical levels.

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